完成首次发酵后，需轻柔地揉捏一段时间，将面团内的气体排出，随后进行15至20分钟的静置松弛。待面团形状稳定后，进入第二次发酵过程。在二次发酵时，无需再次排气，直接送入烤炉进行烘烤。
第二次发酵一般需要40分钟到1小时，直至面团体积膨胀一倍。这个过程也称为最终发酵，通常在约38℃的环境中进行。为保持面团表面湿润，其含水量应保持在85%以上。对于家庭烘焙而言，若缺乏专业的发酵设备，可以利用烤箱创造适宜的发酵温度和湿度环境。
在利用烤箱进行发酵时，可将面团放入烤箱内，同时在烤箱底部放置一盘开水，并紧闭烤箱门。这样，蒸汽便能在烤箱的封闭空间内形成所需的温度和湿度条件。但需注意，随着开水的逐渐冷却，若发酵尚未完成，应及时更换新的开水。
面团发酵的理想温度为25～28℃，这是酵母菌生长繁殖的最佳温度范围。酵母菌通过无性繁殖进行种群扩张，过程中会从母细胞的空腔中产生一条小管，称为中间沟。这条小管逐渐生长至细胞表面，穿过细胞壁形成粗糙的突起，即芽痕。当新核生长至与母细胞相当大小时，母核将分裂为两部分，形成两个完全定位的细胞。此时，母细胞与子细胞完全分离，并继续生成新的芽痕。
酵母菌的繁殖速度受温度影响显著。在4℃的低温下，酵母菌繁殖一代需耗时20小时；而在23℃的较温暖环境中，其生成期缩短至6小时；但当温度升至60℃时，酵母菌将死亡。在面团制作过程中，除酵母菌外，还可能混合有乳酸菌和醋酸菌等其他微生物。乳酸菌最适宜的生长温度为35℃。
需要注意的是，若发酵温度过高于30℃，乳酸菌和醋酸菌将大量繁殖，从而抑制酵母菌的生长，导致面团产生酸味。因此，为确保面团的品质和口感，发酵温度应严格控制在25～28℃之间。